我国奶牛胚胎移植技术现状及发展方向

摘要：奶牛胚胎移植技术就是将一头良种母牛的早期胚胎取出，移植到生理状态相同的另一母牛体内，使胚胎在其体内继续发育至胎儿出生；胚胎移植可充分发挥优良母牛的繁殖潜力，高效率利用良种资源，加快奶牛良种化进程；我国奶牛胚胎移植技术产业化前景广阔，各项技术支持体系已初步建立；产业化运作是该项技术应用的发展方向。

关键词：奶牛；胚胎移植；产业化

 

从20世纪60年代以来，对动物胚胎移植进行了大量试验并取得了显著进展，70年代以后，许多发达国家对牛的胚胎移植已经进入了商业生产阶段，成为一种常规的繁殖手段。我国从20世纪70年代开始牛胚胎移植的研究工作，也已取得较大的成功。胚胎移植是将一头良种母畜的早期胚胎取出，移植到生殖生理状态相同的另一母畜体内，使胚胎在其体内继续发育至胎儿出生。提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个体称为受体。胚胎移植实际上就是产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代的过程。牛的胚胎移植可充分发挥优良母牛的繁殖潜力，提高了母牛的繁殖力，便于良种牛群的建立和扩大，有利于选种工作的进行和品种改良规划的实施，是育种工作的有力手段。应用胚胎移植还可以减少繁殖母畜的饲养头数，可以部分代替种畜的引进、品种资源保存等传统育种方法。

 

在发情后的最初一段时期（周期性黄体期），不论是否受精，生殖系统均处于受精后的生理状态之下，在生理现象上妊娠与未孕并无区别。所以，发情后母畜生殖器官的孕向变化，是进行胚胎移植时未配种受体母畜可以接受胚胎并为胚胎发育提供各种充分条件的主要生理学根据。胚胎在发育早期有相当一段时期（附植之前）是游离于输卵管或子宫腔内，它的发育靠本身贮存的养分，所以在离开活体条件下容易存活，当放回到与供体相同的环境中就可继续发育；同一物种之间移植的胚胎没有免疫排斥现象，所以，当胚胎从供体转移至受体时可以存活下来；受体对胚胎不产生遗传上的影响，不会改变新生个体的遗传特性。

胚胎移植中必须遵循移植前后所处环境的同一性。包括：生理上的一致性，即供体和受体在发情时间上的一致性和解剖部位上的一致性，即移植后的胚胎与移植前所处的空间环境的相似性；胚胎发育的日龄必须与受体发情排卵期的天数相一致；胚胎采集和移植的期限（胚胎的日龄）不能超过周期黄体的寿命。因此，通常在供体发情配种后3～8d内收集胚胎和移植。移植的胚胎必须经过鉴定，证明是发育正常者。在全部操作过程中，胚胎不应受到任何不良因素（物理的、化学的、微生物的）影响。开展胚胎移植必须有充足的具备优良品种基因的胚胎来源。

 

包括超数排卵、供体母牛的配种、胚胎的收集、胚胎的检查、胚胎的保存和胚胎的移植等技术程序。其主要技术程序简介如下：

1　超数排卵　在母牛发情周期的适当时间，注射促性腺激素，使卵巢中有较多的卵泡发育和排卵，这种方法称为超数排卵。在进行胚胎移植时要对供体母牛作超数排卵处理，以便一次取得多枚胚胎。一般认为超排量最好是10个左右，太少会降低胚胎移植的意义，同时胚胎的收集也有困难；超排过多会降低卵子的受精率和收集率。超排处理的一般方法是在预计发情到来之前4d，即发情周期的第16d注射促卵泡素（FSH）或孕马血清促性腺激素(PMSG)，在出现发情的当天注射绒毛膜激素(HCG)。为了使排出的卵子有较多的受精机会，一般在发情后输精2～3次，每次间隔8～12h。母牛对超排处理的个体反应差异较大，其原因可能与母牛的品种、年龄、体况、生理状态、制剂质量、投药方法和剂量等各因素有关。

２　胚胎的收集　从供体收集胚胎的方法有两种：一种是手术法，一种是非手术法。手术法是按外科剖腹术的要求进行术前准备，手术部位于右肋部或腹下乳房至脐部之间的腹白线，切开后伸进食指找到输卵管和子宫角，引出切口外。如果在输精后3～4d期间收集，受精卵绝大多数还未移到子宫角，可采用输卵管冲卵的方法，用注射器吸取冲洗液连接穿刺针头，在子宫角前端刺入，再送入输卵管峡部，注入冲洗液；如果在输精5d后收集，还必须作子宫角取卵，可在子宫角中段插入橡胶双套管，从外管送入空气，使橡皮管顶端的气球膨大紧贴子宫内壁，橡皮管的另一端连接集卵器，然后从子宫角前端插入针头，注入冲洗液3～4次，尽量把冲洗液全部收回在试管或平皿中。非手术法是在输精后5～7d进行，可采用二路或三路导管的冲卵器，用直肠把握法将导管从子宫颈导入子宫角，通过气囊导管打入空气使气囊膨胀以固定导管在子宫角内的位置并防止冲洗液倒流，冲洗液经导管注入子宫角，每次15～50ml，然后将冲洗液收集在漏斗容器内，冲洗5～6次。为更彻底地回收冲洗液，可在直肠内轻轻按摩子宫角。冲洗液一般为组织培养液，如杜氏磷酸缓冲液（PBS）和布林斯特氏液（BMOC-3）等。这两个培养液的成分见表１。

冲洗液使用时的温度应为35～70℃，每毫升要加入青霉素1000IU，链霉素500～1000μg，以防止生殖道感染。把上述方法所回收的冲洗液于室温或37℃温箱内静置10min，待胚胎下沉后，移去上层液，取底部少量液体移至平皿内，先在10～20倍的解剖镜下检查胚胎数量，然后在较大倍数（50～100倍）下观察胚胎发育情况。正常发育的胚胎，其中细胞（卵裂球）外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整。无卵裂现象（未受精）和异常卵（外膜破裂，卵裂球破裂等）都不能用于胚胎移植。把正常发育的胚胎收集于带有密闭盖的玻璃容器内备用贮存。

３　胚胎的保存　如果胚胎能在体外较长期的保存，并使它保持于取卵时状态，对胚胎移植的实际应用有很大的意义。这样就可以免去移植时要求的同期发情处理；可以不受时间、地点和选定受体母牛的限制，随时随地可以进行胚胎移植。胚胎保存的研究近年来发展很快，并已取得了一定的进展。在前述培养液中，如在室温或体温条件下，胚胎只能存活10～20h；当温度降至20℃以下时，胚胎即停止发育；在10℃以下可以存活数日。将牛的胚胎在兔的输卵管内可保存3～4d，据报道，将曾在母兔输卵管内保存3～4d的牛胚胎移植到同期化受体母牛，胚胎成活率可达73%。但是上述方法在时间上是短暂的，受胎率也不高。目前冷冻保存胚胎的研究已取得了初步成功。用于冷冻保存的胚胎以6～7日龄胚胎，即桑椹期至胚泡开始出现时的胚胎效果较好。胚胎冷冻前必须使其脱水，进行冷冻保护剂二甲基亚矾（DMSO）的渗透处理，在室温下（20℃），预先配制含有DMSO浓度为0.25摩尔、0.5摩尔、1.0摩尔、1.5摩尔的加0.4%牛血清白蛋白的PBS溶液（磷酸缓冲液）；将胚胎依次浸入上述不同DMSO浓度的溶液中进行渗透处理，在每个浓度溶液中分别停留5～10min；最后用吸管将含胚胎的溶液移入0.3ml的长颈安瓶中并将口封好，以上操作均在解剖镜下进行；然后将安瓶置于14℃的水浴中。胚胎冷冻以液氮为冷源，在可控制温度的液氮冷冻箱内进行。冷冻及解冻速率如表２所示。

使用胚胎时，按上表要求解冻后，通常在室温下将安瓶打开，脱去冷冻保护剂DMSO。方法是将胚胎依次移入含DMSO浓度为1.25摩尔、1.0摩尔、0.75摩尔、0.5摩尔的磷酸缓冲液中，在每种浓度溶液中各停留5～10min，在0.5摩尔溶液中可停留30min，最后移入不含DMSO的磷酸缓冲溶液中停留10min；再用磷酸缓冲液冲洗二次，取出后检查即可用于移植；也可以培养1h（在37℃培养液中），将其中死的胚胎去掉，效果更好。已经有在液氮中保存46d后移植成功的报道。可见，冷冻保存胚胎虽然冻后成活率和受胎率还很低，还需要在培养液、防冻保护剂、降温和升温速率等方面进行深入的研究，但是这确是胚胎保存技术的重大突破。据统计，胚胎移植的成功率，即受体妊娠率，鲜胚移植达60%～70%，冻胚也达到45%～50%，半胚移植达55.6%。

４　胚胎的移植　胚胎移植也分为手术法和非手术法。手术法如前所述先将受体母牛作好术前准备，在右肋部切口，找到非排卵侧子宫角（已配种母牛），再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宫角前端，注入胚胎；或在每侧子宫角各注入一个胚胎（未配母牛）。注入完毕后即将子宫复位，进行伤口缝合。非手术法移植是用人工授精输精器（卡苏枪）或专用移卵器按照直肠把握输精方法插入非排卵侧子宫角深部，注入胚胎；在诱产双胎为目的的移植一般采用非手术法；非手术法的移植在发情周期的6～9d进行（即胚泡阶段），效果较好；非手术法不损害受体的健康，操作简便，但是还需要克服所注入胚胎易被排出的问题；非手术法移植时要严格遵守无菌操作规程，以防止生殖道感染。不论用何种方法移植胚胎，保证供体和受体的发情期应相同或前后相差不超过24h为宜，否则，将会影响成功率。所以，在胚胎体外保存方法没有得到更好的解决之前，必须对供体和受体同时进行同期发情处理，使两者性腺和生殖道处于相同的生理状态，以提高移植成活率。对供体和受体于术后要注意观察是否发情，供体发情时即可正常配种，或经过40～80d再重复作为供体；受体母牛如未发情，在适当时间进行妊娠检查；若确已妊娠，应加强饲养管理。诱产双胎的受体母牛以成年母牛较好，可以减少分娩困难。

 

 

用黄牛做受体繁殖纯种奶牛和肉牛，是加快牛胚胎移植产业化进程的主要途径。目前，牛胚胎移植技术在我国正处于推广应用阶段，其技术操作程序已逐渐成熟，但在大规模生产中，由于地方黄牛饲养技术落后，其生存条件和营养水平又各有差异，母牛体况和繁殖性能普遍较差，以至移植成功率较低。因此，改善和提高母黄牛的体况和繁殖性能，对提高牛胚胎移植成功率有着极其重要的意义。

１　补饲　对受体母牛加强饲养管理应以增加营养、恢复膘情为主。我国本地黄牛管理粗放、饲料单一，母牛带犊哺乳、体质瘦弱，必须经过补饲培育，才能达到受体牛的选择标准。据报道，在胚胎移植前补饲100d，本地黄牛体况合格率和移植妊娠率都有显著的提高。可见，补饲是提高农养本地黄牛受体利用率，也是提高胚胎移植妊娠率的关键性技术措施之一。

２　生殖道净化处理　母牛生殖系统疾病是影响胚胎移植妊娠率的主要因素之一。地方黄牛约有70％患有各种生殖道疾病，其中某些疾病会导致母牛性周期紊乱，屡配不孕或流产。由于输精器械消毒不严、助产不当或本交不卫生等原因，使母牛患上各种生殖道疾病，可引起精子、合子和胚胎致死。尤其是经产母牛，其子宫自净和复旧能力随配种次数和妊娠次数的增加而下降，很易患上卵巢炎、子宫炎及阴道炎等生殖道炎症。据调查，母牛产后20～30d，其生殖道疾病发病率高达65.6％。在胚胎移植中，对选作受体的黄牛，无论是否明显患有生殖道炎症，都可在移植前7～10d，用广谱抗菌素如红霉素100万IU或青霉素200万IU，链霉素100万IU加稀释液20～40ml或0.2％碘甘油50～100ml注入子宫，可起到防炎抗炎的双重效果，能有效提高胚胎移植妊娠率。

３　利用生殖激素　生殖激素分泌不平衡或分泌紊乱，常常是造成家畜不育的主要原因。近年来，在应用各种生殖激素及其人工合成类似物控制母畜的繁殖活动方面，取得了实用性的进展。在牛胚胎移植中，生殖激素应用于受体母牛，一方面可以直接调节母牛的发情、排卵、胚胎在子宫内的附植、怀孕、分娩等功能，另一方面还能进一步防治母牛生殖疾病。生殖激素在生产实际中主要用于以下几方面：①母牛产后康复。可在母牛产后次日肌注氯前列烯醇0.2～0.4mg；或在母牛产后30d用氯前列烯醇0.2mg，间隔12d再重复1次；或在母牛产后40d左右肌注促排3号（LRH-A3）10μg，间隔6d肌注氯前列烯醇0.2mg，再间隔ld肌注促排3号10μg，受胎率可显著提高20％以上。②治疗卵巢静止。可用促性腺激素释放激素（GnRH）肌注，每次400～500μg，间隔10d，再用１次，；或用促卵泡素（FSH）200IU加促黄体素（LH）100IU，一次肌肉注射；或用孕马血清（PMSG）1000IU，一次肌肉注射，一般于注射后3d内发情。③治疗持久黄体。可用催产素（OT）400IU分2次肌肉注射，或用苯甲酸雌二醇20～30mg肌注，每日2～4次，连用3d，以诱导黄体消退和发情。用上述方法处理后，受体母牛基本上能够恢复正常的繁殖生理状况，于第二情期即可进行统一同期发情处理。除此之外，因黄体产生的孕酮是决定子宫生理状态的主要激素，它对妊娠的建立和维持是必不可少的，故可采用补充孕酮或LH、HCG和促乳素的方法增加内源性孕酮的水平，生产中常用孕酮l00～160mg于移植后l0～l5d肌注，以达到提高胚胎成活率的目的。

４　加强移植后饲养管理　移植后，胚胎要在受体子宫内完成着床及生长发育直至分娩全过程，此时，受体母牛营养水平的高低会影响胚胎的生存。因此，加强移植后受体母牛的饲养管理对于提高胚胎移植成功率起着极其重要的作用。生产中对移植后受体母牛应根据妊娠母牛的营养需要供给适宜的营养，早期要限饲，以防止能量、蛋白质水平过高而引起胚胎早期死亡和流产，但日粮中应搭配营养全面的饲料。移植90d后进行妊娠检查，对确诊已妊娠的受体牛要加强管理，合理搭配日粮，增加能量和蛋白质水平，补充维生素A、D、E、B和微量元素，保持中等以上膘情。同时应禁止使役、鞭打和剧烈运动，做好保胎、防流产等工作，并按预产期做好接产和犊牛护理工作。

值得注意的是，由于青年牛对超排药物反应不强烈，输精和冲胚困难，胚胎质量差以及下次配种困难等原因，青年牛不宜做供体牛；由于青年牛子宫小，子宫内膜又十分娇嫩，任何轻微的机械损伤，都会导致内膜出血，影响受胎率，因此青年牛也不宜做受体牛。可见，青年牛不适宜做胚胎移植。

 

我国奶牛胚胎移植技术必须向产业化方向发展，才具有更强的发展动力和更广泛的发展空间。奶牛胚胎移植的产业化可以高效率利用良种资源，扩大良种畜群规模；可改变群体品质差、良种覆盖率低，个体生产性能差、单位产量低，经营管理水平差的现状；可缩短畜群世代间隔，提高种畜选择强度，加快家畜良种化进程。奶牛胚胎移植技术路线为：

 

奶牛胚胎移植技术产业化必须有下列支持体系：第一，家畜同期发情技术。利用孕激素类制剂人为延长黄体期；利用PGF诱导黄体溶解。成功的同期发情技术是大规模定时人工授精和胚胎移植的基础；第二，超数排卵和胚胎移植技术。第三，性别控制技术。通过鉴定植入前胚胎的性别达到控制所生后代性别的目的；或在受精前将X、Y精子分离，有目的地使X或Y精子参与受精就可以得到XX或XY的动物个体，从而达到控制性别的目的。第四，胚胎分割及卵裂球分离技术。利用显微外科手术将胚胎一分为二，一分为四，或将发育早期的胚胎卵裂球分离，每个1／2或1／4胚胎或分离的卵裂球分别发育成一个个体的技术。目前这项技术以1／2胚为主。第五，使配子及胚胎生产工厂化的技术。包括哺乳动物活体采卵技术、生殖细胞的冷冻保存技术、哺乳动物胚胎的冷冻保存技术、卵子体外成熟和体外受精技术等。

奶牛胚胎移植技术产业化支持体系中的各单项技术已趋于成熟；具备高素质的专业技术人才队伍迅速壮大；国内各生产部门对胚胎移植技术有较充分的认识，这是胚胎移植技术产业化的群众基础；通过改进超排方法有效地利用优秀供体，使之多产胚胎或使用更有效的移植技术可降低生产成本。因此，奶牛胚胎移植技术产业化是切实可行的。实施奶牛胚胎移植技术产业化可使先进的技术迅速转化为生产力，把分散的养牛户通过技术和管理体制连结起来，形成利益共同体，共同抵御市场风险，并分享规模效益。这对于改善农村产业结构，解决农村劳动力转移，增加农民收入均具有积极意义。